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Aug 11, 2023

Klärung der Zusammensetzung der ATP-Verbrauchsfaktoren, die zur Aufrechterhaltung der Ionenhomöostase in Mausstäbchen-Photorezeptoren erforderlich sind

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14161 (2023) Diesen Artikel zitieren 20 Zugriffe auf Metrikdetails Bisher wurde keine wirksame Behandlung für den Verlust von Photorezeptoren aufgrund von Energie etabliert

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14161 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bisher gibt es keine wirksame Behandlung für den Verlust von Photorezeptoren aufgrund von Energieungleichgewichten, doch zahlreiche Therapieansätze haben über gewisse Erfolge bei der Verlangsamung der Degeneration von Photorezeptoren durch Herabregulierung des Energiebedarfs berichtet. Die detaillierten Mechanismen bleiben jedoch unklar. Ziel dieser Studie war es, die Zusammensetzung der ATP-Verbrauchsfaktoren in Photorezeptoren bei Dunkelheit und Licht zu klären. Wir haben mathematische Formeln für Ionenstromaktivitäten in Kombination mit einem Phototransduktionsmodell eingeführt, um ein neues mathematisches Modell zur Schätzung des Energieaufwands jedes Ionenstroms zu erstellen. Das vorgeschlagene Modell umfasste verschiedene Ionenströme, die in Mausstäbchen mithilfe einer Genexpressionsdatenbank identifiziert wurden, die eine verfügbare elektrophysiologische Aufzeichnung jedes spezifischen Gens umfasste. ATP wurde hauptsächlich von Na+/K+-ATPase und Plasmamembran-Ca2+-ATPase-Pumpen verbraucht, um überschüssiges Na+ und Ca2+ zu entfernen. Der Stab verbrauchte 7 \(\times\) 107 Moleküle ATP s−1, wobei 65 % zur Entfernung von Ionen aus dem durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kanal und 20 % aus dem durch Hyperpolarisation aktivierten Strom in der Dunkelheit verwendet wurden. Eine erhöhte Lichtintensität erhöhte den Energiebedarf der komplexen Phototransduktionskaskadenmechanismen. Dennoch war der Gesamtenergieverbrauch aufgrund der deutlichen Reduzierung der ATPase-Aktivitäten geringer als bei Dunkelheit, wo der durch Hyperpolarisation aktivierte Stromanteil auf 83 % anstieg. Ein besseres Verständnis des Energiebedarfs/-angebots kann ein wirksames Instrument zur Untersuchung pathophysiologischer Veränderungen der Netzhaut und zur Analyse neuartiger therapeutischer Behandlungen im Zusammenhang mit dem Energieverbrauch von Photorezeptoren sein.

Es ist bekannt, dass die Netzhaut eines der energieverbrauchendsten Gewebe mit dem höchsten Sauerstoffbedarf im menschlichen Körper ist. Der Großteil der Energie wird hauptsächlich für den Stoffwechselbedarf der Photorezeptoren aufgewendet. Allerdings sind die detaillierten Mechanismen weniger gut verstanden. Es besteht allgemein Einigkeit darüber, dass der Energiebedarf der Photorezeptoren bei Dunkelheit höher ist als bei hellen Bedingungen. Es wird berichtet, dass der ATP-Verbrauch durch Stäbchen bei Dunkelheit etwa 9 \(\times\) 107 Moleküle ATP s−1 und bei hellem Licht 2 \(\times\) 107 Moleküle ATP s−1 beträgt1. Energie wird überwiegend über die Na+/K+-ATPase-Pumpe (INaK) und die Plasmamembran-Ca2+-ATPase-Pumpe (IPMCA) verbraucht, um überschüssiges Na+ bzw. Ca2+ zu entfernen. Ein ATP-Molekül wird hydrolysiert, um über INaK drei Na+-Ionen aus der Zelle und zwei K+-Ionen in die Zelle zu transportieren, wohingegen IPMCA eine Stöchiometrie von 1:1 aufweist, d. h. ein Ca2+ pro hydrolysiertem ATP.

Die ersten Schritte des Sehens, die durch Photorezeptoren über die lichtinduzierte Isomerisierung von 11-cis-Retinal zu all-trans-Retinal dargestellt werden, lösen die Phototransduktionskaskade und den anschließenden Rückgang der cGMP-Konzentration aus, was zur Schließung des lichtempfindlichen Stroms und zur neuronalen Hyperpolarisation führt. Es wurde vermutet, dass der Energieverbrauch der komplexen Transduktionskaskaden bei sättigender Beleuchtung im Vergleich zum Gesamtenergieverbrauch bei Dunkelheit relativ gering ist1. Diese Beweise könnten die Ansicht stützen, dass Photorezeptoren den größten Teil ihrer Energie verwenden, um die Ionenhomöostase über INaK und IPMCA in Dunkelheit und Licht aufrechtzuerhalten. Das Verständnis der Grundlagen der ionenhomöostatischen Regulierungsmechanismen könnte die Entwicklung wirksamer Behandlungsstrategien für Netzhauterkrankungen ermöglichen, die mit dem Energieverbrauch von Photorezeptoren zusammenhängen.

Photorezeptoren absorbieren Nährstoffe und Sauerstoff, um Energie aus dem Pigmentepithel der Netzhaut zu erzeugen. Mitochondriale oxidative Phosphorylierung ist die Hauptbrennstoffquelle für Photorezeptoren. Eine kontinuierliche O2-Versorgung ist für Photorezeptoren unerlässlich, da dieser nicht gespeichert werden kann. Eine Störung im Gleichgewicht zwischen Sauerstoffangebot und Energiebedarf beeinträchtigt die oxidative Phosphorylierung und führt zu vielen Netzhauterkrankungen wie Retinitis pigmentosa, altersbedingter Makuladegeneration und Netzhautablösung. Stäbchen sind empfindlicher als Zapfen. Morphologische Anomalien bei menschlichen Stäbchen können nach dem 30. Lebensjahr beobachtet werden. Bei der altersbedingten Makuladegeneration sind Stäbchen früher und schwerwiegender betroffen als Zapfen3. Eine Abnahme der Mitochondrien verringert das Zellmembranpotential und die Energieversorgung, was zu einer Zunahme reaktiver Sauerstoffspezies und einem Verlust von Photorezeptoren führt4. Bisher wurde keine wirksame Behandlung für den Verlust von Photorezeptoren etabliert, aber zahlreiche Therapieansätze haben über gewisse Erfolge bei der Verlangsamung der Degeneration von Photorezeptoren durch Herunterregulieren des Energiebedarfs berichtet.

In Versuchen, die Überlebensfähigkeit von Photorezeptoren zu verbessern und Sehverlust zu verhindern, wurde in mehreren Studien über einige neuroprotektive Therapien berichtet, wie etwa ein Adenosinmonophosphat-aktivierter Proteinkinase-Aktivator zur Aufrechterhaltung des ATP-Spiegels unter Photostress5, eine ketogene und proteinarme Diät zur Verlangsamung der Netzhautdegeneration6 und Nicotinamid Mononukleotid zur Wiederherstellung der Netzhautablösung7. Darüber hinaus haben einige Studien eine Verbesserung der Mitochondrienfunktion und eine Verringerung des Zellverlusts durch lange Wellenlängen gezeigt, die bei der Mitochondrienatmung absorbiert werden4,8. Ein besseres Verständnis des entscheidenden Energiebedarfs in Photorezeptoren, dh der Ionenstromaktivitäten, könnte ein wirksames Instrument zur Untersuchung pathophysiologischer Veränderungen der Netzhaut und zur Analyse neuartiger therapeutischer Behandlungen im Zusammenhang mit dem Energieverbrauch von Photorezeptoren sein.

Mathematische Modelle haben umfassende Einblicke in komplexe biophysiologische Phänomene geliefert und werden häufig zur Beschreibung klinischer und experimenteller Studien eingesetzt. Mehrere leitfähigkeitsbasierte Modelle von Stäbchen-Photorezeptoren haben die Veränderungen der elektrischen Eigenschaften, Ionenströme und lichtempfindlichen Ströme als Reaktion auf Licht in niederen Photorezeptoren von Wirbeltieren gut beschrieben9,10,11. Allerdings wurden die Veränderungen der intrazellulären Ionenkonzentrationen, die für die Bewertung der treibenden Kraft jedes Ionenstroms und die Schätzung des Energieaufwands über INaK und IPMCA wesentlich sind, nicht detailliert beschrieben. Darüber hinaus bestehen elektrophysiologische und morphologische Unterschiede zwischen den Stäbchenphotorezeptoren niederer Wirbeltiere und Säugetiere.

In dieser Vorstudie wollten wir die Zusammensetzung der ATP-Verbrauchsfaktoren von Mausstäbchen-Photorezeptoren bei Dunkelheit und Licht klären. Die mathematischen Formeln für Ionenstromaktivitäten wurden in Kombination mit einem Phototransduktionsmodell eingeführt, um ein neues mathematisches Modell zur Schätzung des Energieaufwands jedes Ionenstroms zu bilden. Das vorgeschlagene Modell soll ein besseres Verständnis der entscheidenden Rolle physiologischer Phänomene mit detaillierten Mechanismen liefern, die erklären könnten, wie Photorezeptoren die Ionenhomöostase als Reaktion auf Licht und Dunkelheit aufrechterhalten.

Die Gene, die für Ionenkanäle in Mausstäbchen kodieren, wurden mittels Einzelzell-RNA-Seq-Analyse12 entdeckt. Das vorgeschlagene Modell bestand aus verschiedenen Ionenkanälen, Ionenpumpen, Austauschern und Transportern, die mithilfe einer Genexpressionsdatenbank identifiziert wurden, die eine verfügbare elektrophysiologische Aufzeichnung jedes spezifischen Gens enthielt (Tabelle 1).

Stäbchenphotorezeptoren bestehen aus vier Teilen: Außensegment, Innensegment, Zellkörper und synaptischem Terminal. Zur Vereinfachung wird der Stäbchenphotorezeptor in der aktuellen Forschung wie in früheren Studien9,10 in zwei Kompartimente unterteilt: (1) äußeres Segment und (2) inneres Segment mit Zellkörper und synaptischem Terminal (Abb. 1).

Schematische Darstellung des Mausstäbchen-Photorezeptormodells in der aktuellen Studie. (Oben) verschiedene Ionenkanäle, Ionenpumpen, Austauscher, Transporte, intrazelluläres Kalziumsystem und essentielle Ionenarten (K+, Na+ und Cl−), (Unten) zwei Hauptkompartimente: (1) äußeres Segment und (2) inneres Segment mit Zellkörper und synaptischem Terminal.

Der zyklische Nukleotid-gesteuerte Ionenkanal (ICNG) und der kaliumabhängige Natrium/Kalzium-Austauscher (INCKX) sind nur in der Plasmamembran des äußeren Segments zu finden. ICNG, ein nichtselektiver Kationenkanal ohne nennenswerte Anionenpermeabilität, wird durch die lichtempfindliche Leitfähigkeit zweier Botenmoleküle, cGMP und Ca2+, gesteuert. ICNG bildet heterotetramere Komplexe, die aus drei Cnga1-Untereinheiten und einer Cngb1-Untereinheit28 bestehen und Na+- und Ca2+-Einströme sowie K+-Ausströme vermitteln. Die Permeabilitätsverhältnisse von Na+ im Verhältnis zu K+ und Na+ im Verhältnis zu Ca2+ betragen ungefähr 1 bzw. 2–629,30,31,32. INCKX hat einen stöchiometrischen Austausch von vier Na+ gegen ein Ca2+ und ein K+ und spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Ca2+-Ausflussfunktion im äußeren Segment. Der homomere Kanal von INCKX wird durch Slc24a1-Gene oder NCKX1-Proteine ​​gebildet, die in Mausstäbchen stark exprimiert werden33. Die Amplitude von INCKX in Salamander-Photorezeptoren beträgt ~ 10 % von ICNG und es wurde vermutet, dass sie der von Mäusen ähnelt17.

Frühere Studien haben mindestens fünf Arten von Ionenkanälen identifiziert, die im inneren Segment und am synaptischen Ende von Amphibien-Photorezeptoren identifiziert wurden, darunter der hyperpolarisationsaktivierte Kanal (Ih), der verzögert gleichrichtende K+-Kanal (IKx), der spannungsgesteuerte Ca2+-Kanal (ICa) und Ca2+ -abhängiger K+-Kanal (IKCa) und Ca2+-abhängiger Cl--Kanal (IClCa)34,35,36. Wir gingen davon aus, dass das elektrophysiologische Verhalten jeder Tierart ein ähnliches Muster aufweisen könnte, wenn die Gene, die für Ionenkanäle kodieren, keine grundlegend unterschiedlichen Genexpressionsprofile aufweisen. Ih wird vom Hcn1-Gen kodiert, das in Mausstäbchen stark exprimiert wird12,23. Hcn1 bildet einen funktionellen homomeren Kanal für den Na+-Einstrom und K+-Ausfluss mit einem relativen Permeabilitätsverhältnis für Na+ und K+ (PNa/PK) von 0,3–0,3637,38,39. Dieser Kanal spielt eine entscheidende Rolle bei der Gestaltung des anfänglichen Übergangs in der Membranhyperpolarisation von Stäbchenphotorezeptoren als Reaktion auf Licht. IKx oder nichtinaktivierende K+-Kanäle wurden kürzlich als spannungsgesteuerte K+-Kanäle (IKv) oder verzögerte Gleichrichter-Kaliumströme klassifiziert21. Sie bestehen aus heteromeren Tetrameren aus vier porenbildenden α-Untereinheiten, darunter drei Kcnb1-Untereinheiten und einer Kcnv2-Untereinheit22. Ähnlich wie ICNG ist ICa hauptsächlich für den kontinuierlichen Ca2+-Einstrom in das synaptische Terminal verantwortlich. Dieser Kanal besteht aus der porenbildenden α1-Untereinheit und den Hilfsuntereinheiten α2δ und β. Das Cacna1f- oder Cav1.4-Gen kodiert für die α1F-Untereinheit des spannungsgesteuerten L-Typ-Ca2+-Kanals (ICaL), der vorwiegend in Mausstäbchen exprimiert wird40. Die α1F-Untereinheit besteht aus vier homologen Domänen mit sechs α-helikalen transmembrandurchspannenden Segmenten in jeder Domäne. IKCa und IClCa, Ca2+-abhängige Kanäle, wurden in Photorezeptoren identifiziert. Über IKCa wurde in der Netzhaut des Tigersalamanders berichtet36, es bleibt jedoch unklar, ob IKCa in Mäusestäbchen gefunden werden kann12,41. IClCa hat eine entscheidende physiologische Funktion und wird in vielen Zellen weit verbreitet exprimiert. In Mausstäbchen reguliert IClCa die Signalübertragung an synaptischen Terminals26. Die elektrophysiologischen Eigenschaften von IClCa werden durch die Membranspannung und die freie intrazelluläre Ca2+-Konzentration gesteuert9,10.

Um die Ionenhomöostase herzustellen und aufrechtzuerhalten, sind zusätzliche Ionenströme erforderlich. In der aktuellen Studie haben wir fünf Ionenströme und fünf nicht identifizierte Leckströme hinzugefügt, darunter INaK, IPMCA, Na+/Ca2+-Austauscher (INCX), den Fluss des Na+-K+-2Cl−-Cotransporters (JNKCC1) und den Fluss von K+-Cl − Cotransporter (JKCC2), Ca2+-Leckkanal im äußeren Segment (IL,Caos), Ca2+-Leckkanal im inneren Segment (IL,Cais), K+-Leckkanal (IL,K), Na+-Leckkanal (IL,Na) und Cl−-Leck Kanal (IL,K). In Mausstäbchen-Photorezeptoren gibt es zwei Arten von ATP-abhängigen Pumpen: INaK und IPMCA. Es wurde gezeigt, dass INaK im inneren Segment von Mausstäbchen ein hohes Expressionsniveau aufweist42,43. INaK besteht aus zwei Untereinheiten, der α- und der β-Untereinheit. Die α3β2-Isoform (Atp1a3/Atp1b2) wird hauptsächlich in Mausstäbchen exprimiert12, und Na+-, K+- und ATP-Bindungsstellen befinden sich an der α3-Untereinheit. INaK spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Konzentrationsgradienten für Na+ und K+. Ein ATP-Molekül wird hydrolysiert, um drei Na+-Ionen aus der Zelle und zwei K+-Ionen in die Zelle zu pumpen. IPMCA spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der intrazellulären Ca2+-Homöostase. Für jedes hydrolysierte ATP wird über IPMCA-Pumpen ein Ca2+ abgepumpt. Die Atp2b1-Isoform von IPMCA wird im IPMCA von Mausstäbchen stark exprimiert12. INCX extrudiert ein Ca2+ aus der Zelle im Austausch dafür, dass drei Na+-Ionen in die Zelle gelangen. Es gibt drei Isoformen von INCX, darunter die Isoformen Slc8a1, Slc8a2 und Slc8a3. Es bleibt unklar, welche Isoform in Mausstäbchen exprimiert wird. Johnson et al.44 zeigten eine hohe Expression der Slc8a1-Isoform. Allerdings fanden Clark et al.12 nur eine geringe Expression der Slc8a3-Isoform in Mausstäbchen. In Photorezeptoren wurden zwei elektroneutrale Arten von Cotransportern identifiziert, die aus Na+-K+-2Cl−- und K+-Cl−-Cotransportern bestehen12,45. Der Na+-K+-2Cl−-Cotransporter ist ein wichtiger Cl−-Aufnahmetransporter, der vorwiegend in prä- und postsynaptischen Regionen der äußeren plexiformen Schicht in der Netzhaut der Maus exprimiert wird. Im Gegensatz dazu ist der K+-Cl−-Cotransporter ein primärer Cl−-Extruder. Sowohl Na+-K+-2Cl- als auch K+-Cl-Cotransporter sind für die Aufrechterhaltung des Zellvolumens und der Cl-Homöostase unerlässlich. Bis heute ist die Rolle von Cl− in Mausstäbchen unklar. Darüber hinaus waren für die Modellanpassung fünf nicht identifizierte Leckkanäle erforderlich, bestehend aus drei nicht identifizierten Leckkanälen, einschließlich K+, Na+ und Cl−, und zwei nicht identifizierten Ca2+-Leckkanälen, unterteilt nach Position (äußere und innere Segmente).

Frühere mathematische Modelle wurden mit signifikanten Ionenströmen vorgeschlagen9,10,11; Sie weisen jedoch einige Einschränkungen hinsichtlich der Aufrechterhaltung der Ionenhomöostase auf, die für die Schätzung des Energieverbrauchs erforderlich ist. In der aktuellen Studie wurde aus unseren früheren Arbeiten ein neuartiges mathematisches Modell des Mausstabs entwickelt46. Wir haben mathematische Formeln für Ionenstromaktivitäten in Kombination mit einem Phototransduktionsmodell eingeführt. Die Änderungen der Ionenströme mit der Änderung der Ionenkonzentration wurden durch das klassische Goldman-Hodgkin-Katz-Konstantfeld (GHK) und die Nernst-Gleichungen neu definiert, die häufig zur Erklärung elektrophysiologischer Phänomene der Zellmembran verwendet werden. Die Membranspannung des Mausstäbchen-Photorezeptors wurde durch die gewöhnliche Differentialgleichung (Gleichung 1) bestimmt.

Dabei sind „Cm“ und „Vm“ die Membrankapazität bzw. das Potenzial. „IAll“ ist die Summe aller Ionenströme (Abb. 1, Tabelle 1). Die Ionenströme „I“ wurden mithilfe einer Kombination verfügbarer elektrophysiologischer Aufzeichnungen und mathematischer Formeln berechnet, die denen in früheren Studien ähneln10,23,47,48,49,50,51,52,53,54, die in drei Kategorien eingeteilt werden können Gruppen: (1) einzelner Ionenflusskanal (Gleichung 2) für IKv, IKCa und IClCa, (2) mehrere Ionenflusskanäle (Gleichung 3) für ICNG, Ih und ICaL und (3) vereinfachte Formeln aus veröffentlichten Daten für INCKX, IPMCA, INCX, INaK, JNKCC1 und JKCC2 (Ergänzungsmaterialien).

Dabei werden die Aktivierungsvariable, die Inaktivierungsvariable und der Gating-Exponent durch „m“, „h“ bzw. „M“ dargestellt. Die Modifikationen und die detaillierten Gleichungen sind in den Zusatzmaterialien beschrieben. Das „g“ bezieht sich auf die Leitfähigkeit. Das Umkehrpotential (Eion) von Ca2+, K+, Na+ und Cl- basiert auf der Nernst-Gleichung (Gleichung 4) und „CF,ion“ ist die GHK-Konstantfeldgleichung (Gleichung 5).

Dabei ist „F“ die Faradaysche Konstante, „T“ die Temperatur in Kelvin und „R“ die ideale Gaskonstante. [ion]o und [ion]i sind die Konzentrationen extrazellulärer bzw. intrazellulärer Ionenspezies. Die Wertigkeit des Ions ist „z“. Die Berechnungen der intrazellulären Kalziumsysteme wurden unter Verwendung der tatsächlichen Ströme und Puffersysteme aus früheren mathematischen Studien entwickelt10,52. Die Konzentration von Ca2+ in äußeren Segmenten wird durch ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Zustrom über ICNG-Kanäle und Extrusion über den INCKX-Austauscher (Gleichung 6) gesteuert (Einzelheiten siehe Zusatzmaterialien 3). Im inneren Segment wird der Kalziumeinstrom durch den ICaL-Strom organisiert und das Kalzium wird über zwei Ionenströme, INCX und IPMCA, freigesetzt (Gl. 7).

Dabei ist „[Ca2+]“ die Calciumkonzentration, „V“ das Zellvolumen und die Indizes „os“, „is“, „b“ und „dif“ beziehen sich auf das äußere Segment, das innere Segment, den Puffer und die Diffusion , jeweils. Die Änderungen in jedem [Ion]i wurden durch den Fluss einzelner Ionenströme geschätzt und sind gegeben durch \(d\left[\mathrm{ion}\right]/dt=I/(z\cdot F\cdot V)\) . Der Energieaufwand aus Ionenstromaktivitäten wurde anhand der Flüsse der Na+-Aufnahme über ICNG, INCKX, Ih, ICaL, INCX, JNKCC1 und IL,Na geschätzt. Jedes ATP-Molekül wird hydrolysiert, um drei Na+ über INaK aus der Zelle zu transportieren (Gl. 8). Die Aufnahme und Freisetzung von Ca2+ wurde durch Gl. beschrieben. (7); Für die Extrusion von überschüssigem Ca2+ über IPMCA ist jedoch ein ATP-Molekül erforderlich, und das erforderliche ATP wurde durch Gleichung (1) bestimmt. (9) (siehe ergänzende Materialien für d[Na+]influx/dt und d[Ca2+]influx/dt).

wobei NA sich auf die Avogadro-Konstante bezieht. In der Lichtumgebung ist für den komplexen Mechanismus der Phototransduktionskaskade zusätzliche Energie erforderlich. Die molekularen Mechanismen, die der komplexen Transduktionskaskade zugrunde liegen, können mithilfe des mathematischen Modells aus früheren Studien beschrieben werden50,51,52,53,54.

Die Modellparameter jedes Ionenstroms wurden mit experimentellen Erkenntnissen und theoretischen Arbeiten neu angepasst. Das Modell basierte auf der Standardform der Differentialgleichung und die numerische Integration wurde mit der Euler-Methode durchgeführt.

Die folgenden Dimensionen wurden in diesem Modell angewendet: Millivolt (mV) für Membranpotential, Picoampere (pA), Picoampere pro Picofarad (pA/pF) oder Femtoampere pro Picofarad (fA/pF) für Ionenstrom, Millimolar (mM) oder Mikromolar ( μM) für die Konzentration und Sekunde (s) und Millisekunde (ms) für die Zeit. Alle Codes für das Simulationsprogramm wurden mit Microsoft Visual Studio Community 2019 (Microsoft Corp.) erstellt.

Wenn der Photorezeptor Licht ausgesetzt wird, werden die Transduktionskaskaden aktiviert, was zum Schließen der lichtempfindlichen Kanäle und anschließend zur Hyperpolarisation führt. In der aktuellen Studie haben wir die Reaktionen von Mausstäbchen-Photorezeptoren auf verschiedene Lichtintensitäten reproduziert, die in früheren Studien beschrieben wurden13,52. Abbildung 2 zeigt die Simulationsergebnisse der Reaktion des Mausstäbchen-Photorezeptors auf verschiedene Lichtblitzintensitäten. Bei hohen Lichtblitzintensitäten war die Membranspannung auf unter −55 mV hyperpolarisiert und ICNG und INCKX lagen nahe Null. Die Menge an lichtaktivierter cGMP-Phosphodiesterase, die erforderlich war, um eine halbmaximale Reaktion hervorzurufen, betrug ungefähr 43,5 Photonen μm−2 s−1 und die Zeit bis zum Spitzenwert betrug 185 ms (Abb. 1S). Die Calciumhomöostase im äußeren Segment wird durch ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Ca2+-Zustrom und Ca2+-Extrusion über ICNG bzw. INCKX reguliert. Hyperpolarisation führt bei den meisten Ionenströmen mit Ausnahme von Ih und IClCa zu einer Verringerung der Ionentransportereignisse. Sowohl Ih als auch IClCa wurden als Reaktion auf Lichteinwirkung aktiviert und ihre maximalen Amplituden betrugen jeweils −3,9 und −0,4 pA/pF und erreichten ihren Höhepunkt bei 47 bzw. 34 ms. Die verringerten Ionentransportaktivitäten führten zu einem Anstieg von [K+] und einem Rückgang von [Ca2+], [Na+], [Cl−] und [cGMP]. Allerdings benötigten die K+-, Na+- und Cl−-Konzentrationen etwa 785, 723 bzw. 680 s, um in der Dunkelheit nach hochintensiven Lichtblitzsimulationen wieder auf ihren Ausgangswert zurückzukehren. Der Spitzenwert des gesamten Energieaufwands über INaK-, IPMCA- und Phototransduktionskaskadenmechanismen lag bei etwa 7 \(\times\) 107 Molekülen ATP s−1 (Abb. 3).

Elektrophysiologische Eigenschaften des Membranpotentials und verschiedener Ionenströme des Mausstäbchen-Photorezeptors als Reaktion auf Lichtblitz-Exposition. Simulationsergebnisse der Lichtreaktionen wurden bei verschiedenen Lichtblitzintensitäten (Jhv) durchgeführt; 1,7, 4,8, 15,2, 39,4, 125, 444, 1406 und 4630 Photonen μm−2 s−1 von Grau nach Schwarz (mit Farbverlauf). Die Reaktionen begannen zum Zeitpunkt 0,5 s und die Reize bestanden aus 20 ms langen Blitzen. Die Sammelfläche betrug 0,43 μm252 und die Membrankapazität betrug 3,6 pF55.

ATP-Verbrauch von Mausstäbchen-Photorezeptoren, der für die Ionenextrusion und Phototransduktion in Dunkelheit (D) und Licht (L) erforderlich ist.

Der gesamte ATP-Verbrauch, der für die Na+- und Ca2+-Extrusionen erforderlich war, betrug 7 \(\times\) 107 Moleküle ATP s−1 in der Dunkelheit zur Aufrechterhaltung der Ionenhomöostase, die nach Belichtung deutlich abnahm. Ungefähr 4,3 \(\times\) 107 Moleküle ATP s−1 (62,4 % des gesamten Energieaufwands bei Dunkelheit) waren für die Ionenextrusion und Phototransduktion unter kontinuierlicher Hochintensitätslichtsimulation erforderlich (Abb. 3). Eine Extrusion von überschüssigem Na+ über INaK verbrauchte 5 \(\times\) 107 Moleküle ATP s−1 in der Dunkelheit. ICNG (65 %), INCKX (14 %) und Ih (20 %) trugen erheblich zur Na+-Aufnahme in der Dunkelheit bei (Abb. 4); die anderen Ionenkanäle (1 %), darunter ICaL, INCX, JNKCC1 und IL,Na, hatten jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die gesamte Na+-Aufnahme (Abb. 3). Im Licht stieg der Anteil des gesamten Energieaufwands über Ih auf 83 %, während die Na+-Aufnahme über andere Ströme nahe Null lag. Andererseits wurden etwa 2 \(\times\) 107 Moleküle ATP s−1 für die Freisetzung überschüssiger Ca2+-Ionen über IPMCA in der Dunkelheit verbraucht, aber nur 6,3 \(\times\) 106 Moleküle ATP s−1 bei hellem Licht.

Veränderungen im Na+- und K+-Fluss der Hauptionenströme durch die Plasmamembran im aktuellen Modell des Mausstäbchen-Photorezeptors bei Dunkelheit und Licht. OS-Außensegment, IS-Innensegment mit Zellkörper und synaptischem Terminal.

Die Simulation des Maus-Photorezeptors als Reaktion auf 5 s konstantes Licht zeigte eine Verringerung der Membranpotentialamplitude. Dennoch blieb die Plateauphase in den hochintensiven Lichtblitzsimulationen im Bereich von –45 bis –50 mV (Abb. 5A). Der gesamte ATP-Verbrauch nahm nach Lichteinwirkung deutlich ab (Abb. 5B). Im Gegensatz dazu stieg der Energieverbrauch über die Phototransduktionskaskade linear mit zunehmender Intensität (Abb. 5C). Unter konstantem Licht hoher Intensität verringerte sich das für die Extrusion von Na+ und Ca2+ erforderliche ATP um etwa 27,6 % bzw. 65,9 % gegenüber dem Anfangswert in der Dunkelheit (Abb. 5D). Die Niveaus der K+- und Cl−-Konzentrationen veränderten sich leicht, während Na+ und Ca2+ unter hochintensiven Konstantlichtsimulationen dramatisch abnahmen (Abb. 5E,F).

Membranspannung, Energieverbrauch und Änderungen der Ionenkonzentrationen während Simulationen mit konstantem Licht. Simulationen wurden bei verschiedenen Lichtintensitäten (Jhv) durchgeführt: 1,7, 4,8, 15,2, 39,4, 125, 444, 1406 und 4630 Photonen μm−2 s−1 von Grau nach Schwarz (mit Farbverlauf). Die Reaktionen begannen zum Zeitpunkt 0 s und die Reize bestanden aus 5 s konstantem Licht. (A) Membranpotential (mV), (B) Gesamtenergieaufwand (Moleküle ATP), (C) Energieverbrauch über Phototransduktionskaskaden (Moleküle s−1), (D) Gesamtenergieaufwand und erforderliches ATP für Na+- und Ca2+-Extrusionen ( Moleküle s−1), (E) Änderungen von [K+] und [Cl−] gegenüber den Anfangswerten (% s−1), (F) Änderungen von [Na+], [Ca2+]os und [Ca2+] gegenüber den Anfangswerten Werte (% s−1) und (C–F) jeder Parameter wurde nach 5 s aufgezeichnet.

Im äußeren Segment betrug der Gesamtstrom bestehend aus ICNG (94,4 %) und INCKX (5,6 %) unter dunklen Bedingungen etwa – 15 pA, was durch experimentelle Beobachtungen gezeigt wurde56,57. Es wurden ungefähr 4 × 107 Moleküle ATP s−1 verwendet, um Na+ über INaK zu extrudieren (3,3 × 107 Moleküle ATP s−1 und 7 × 106 Moleküle ATP s −1 über ICNG bzw. INCKX). Nach der Belichtung mit hellem Licht sank sie um etwa 2,7 × 106 ATP s−1 pro pA ATP-Verbrauchsrate auf nahezu Null. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Annahmen überein1 und die elektrophysiologischen Eigenschaften passen gut zu den experimentellen Daten13 und dem mathematischen Modell52. Der Na+-Einstrom von ICNG (90 % der gesamten ICNG-Einflüsse) war größer als der Ca2+-Einstrom in der Dunkelheit. Die Anstiegsphase und die Intensitäts-Reaktionskurve von ICNG stimmten gut mit experimentellen Daten und theoretischen Arbeiten überein50,51,52,53,54.

Ih ist für die Formung der potenziellen Reaktion der Membran auf Licht verantwortlich, dh für die Eigenschaften des Peak-Plateau-Durchhangs36. Wir haben die Aktivierungs- und Inaktivierungsparameter von Ih geändert, um sie an den Peak-Plateau-Durchhang des Membranpotentials anzupassen, wie bereits berichtet9,10,11,17,18,19. Das hyperpolarisierte Spitzenmembranpotential lag unter –55 mV und die Plateauphase lag in Simulationen mit hochintensivem Licht im Bereich von –45 bis –50 mV. Ih trug zu einer Na+-Aufnahme von etwa 20 % in der Dunkelheit bei, und die Na+-Aufnahme erhöhte sich unter kontinuierlichen Simulationen mit hochintensivem Licht um das 3,5-fache stärker als in der Dunkelheit. Ungefähr 3,6 × 107 Moleküle ATP s−1 wurden für die Extrusion von überschüssigem Na+ aus Ih bei hellem Licht verbraucht. Diese Ergebnisse unterscheiden sich von früheren Berichten1 aufgrund einer unterschiedlichen Form des charakteristischen Peak-Plateau-Durchhangs des Membranpotentials. Der Energieverbrauch für die Extrusion von überschüssigem Ca2+ über IPMCA in der Dunkelheit war ähnlich dem von Okawa et al.1 berichteten und trug etwa ein Drittel zum gesamten Energieverbrauch oder die Hälfte der über Dunkelstrom in der Dunkelheit verbrauchten Energie bei. Das Modell wurde angepasst, um die intrazelluläre Ca2+-Homöostase über IPMCA und INCX für die Ca2+-Extrusion und ICaL und IL,Cais für die Ca2+-Aufnahme aufrechtzuerhalten. Die Rolle der Ca2+-Extrusion über IPMCA und INCX in den Photorezeptoren von Mausstäbchen ist jedoch nicht vollständig geklärt. Immunhistochemisch zeigten die synaptischen Terminals von Photorezeptoren von Säugetieren eine starke bzw. sehr schwache Färbung für IPMCA bzw. INCX58. Es wurde vermutet, dass ICaL und IPMCA eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der intrazellulären Ca2+-Homöostase in Säugetier-Photorezeptoren spielen. Das ICaL ist für die Neurotransmission visueller Signale verantwortlich. Mutationen im menschlichen Cav1.4-Gen, das für ICaL kodiert, wurden mit angeborener stationärer Nachtblindheit Typ 2 in Verbindung gebracht. Diese Krankheit wurde funktionell in drei Typen eingeteilt: Funktionsverlust, Funktionsgewinn und Funktionsstörung des C-terminalen Modulators59 , was zu einem Anstieg oder Rückgang des Energieverbrauchs für die Ca2+-Extrusion über IPMCA führen kann. Ob es jedoch zu einer Zunahme oder Abnahme der IPMCA-Dichte kommt, konnte bisher bei keiner der Mutationen in Cav1.4-Genen nachgewiesen werden.

INaK spielt eine entscheidende Rolle bei der K+-Aufnahme und der Na+-Extrusion, um einen hohen K+-Wert und einen niedrigen Na+-Konzentrationsgrad in den Photorezeptoren aufrechtzuerhalten und so das normale Ruhemembranpotential zu etablieren. Bisher ist INaK die einzige Pumpe, die überschüssige Na+-Ionen freisetzen kann. Die α3β2-Isoform-Strom-Membranpotential-Beziehung wurde durch den spannungsabhängigen Strom unter Verwendung der Boltzmann-Beziehung23,60 charakterisiert. Es kann bei etwa 80 % bzw. 65 % des Sättigungsmaximums von INaK im Ruhezustand und bei Vm unter –55 mV betrieben werden. Das aktuelle Modell zeigte eine schnelle Erholung der INaK-Aktivität nach der Hyperpolarisierung des Photorezeptors, was zu einem verringerten Na+ und einem erhöhten K+ führte. Der Übergangszustand von INaK von der Dunkelheit zum Licht bleibt jedoch ungelöst. Weitere experimentelle Studien müssen möglicherweise den Unterschied in der Ionenkonzentration zwischen Dunkelheit und Licht berücksichtigen. Eine Unfähigkeit, die Ionenhomöostase aufrechtzuerhalten, wie z. B. ein ATP-Mangel oder ein Ausfall der Ionenpumpe, kann zu Apoptose und Pathogenese führen61. Das überschüssige K+ wurde hauptsächlich über IKv, ICNG und Ih von Photorezeptoren freigesetzt, wobei etwa 49,5 %, 20,9 % und 19,3 % der gesamten K+-Extrusion bei Dunkelheit und 35,1 %, 0 % und 61,8 % der absoluten K+-Extrusion bei kontinuierlichem Hoch ausmachen -Intensitätslichtsimulationen (Abb. 4 und Tabelle 2). Die Beiträge der Ionenkanäle zum Auswärtsstrom in der Dunkelheit betrugen 35,5 %, 35,5 %, 26,2 % bzw. 3 % für IKv, INaK, IPMCA und IKCa, was mit früheren Annahmen vergleichbar ist23. IKCa-Kanäle werden jedoch nur in geringem Maße exprimiert, wie in der Genexpressionsdatenbank von Mausstäbchen gezeigt12.

IClCa, INKCC1, IKCC2 und IL,Cl, die mit Chloridflüssen assoziiert sind, spielen eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung des Membranpotentials von Photorezeptoren während präsynaptischer Aktivität und präsynaptischer Ca2+-Kanalmodulation. Dennoch sind Veränderungen der intrazellulären Cl−-Konzentration im physiologischen Bereich nicht vollständig verstanden. Beachten Sie, dass in der aktuellen Studie der Chloridzufluss und -abfluss angepasst wurde, um den niedrigen Energiebedarf für die Na+-Extrusion aufrechtzuerhalten. Unter Verwendung der mathematischen Formeln für IClCa9,10 zeigten die Simulationsergebnisse der elektrophysiologischen Eigenschaften unterschiedliche Merkmale aufgrund der Auswirkungen der elektrochemischen Antriebskraft, die sich in der Nernst-Gleichung manifestiert. Andererseits waren zwei elektroneutrale Arten von Kationen-Chlorid-Cotransportern, INKCC1 und IKCC2, für die zelluläre Homöostase von entscheidender Bedeutung (Abb. 6). INKCC1 wird an Stabterminals stark exprimiert. Dieser Cotransporter ist für die Cl−-Aufnahme verantwortlich und sorgt für die Aufrechterhaltung eines Cl−-Gleichgewichtspotentials. Im Gegensatz zu INKCC1 ist IKCC2 der wichtigste Cl−-Extruder, der die schnelle hyperpolarisierende postsynaptische Hemmung im Gehirn62 und der inneren Netzhaut45 fördert, aber die Rolle von IKCC2 in Mausstäbchen ist noch unklar. Es gibt mehrere einfache mathematische Gleichungen, um die Chloridregulation in Neuronen zu bewerten49,63. Diese Gleichungen können die depolarisierende Wirkung von INKCC1 und die hyperpolarisierende Wirkung von IKCC2 verdeutlichen, ein Konzept, das auf diesem Gebiet weithin anerkannt ist64. Allerdings sind die mathematischen Formeln für Mausstäbchen noch immer kaum verstanden.

Chloridhomöostase im Mausstäbchen in der aktuellen Studie. IS-Innensegment mit Zellkörper und synaptischem Terminal.

Nach hochintensiven Lichtblitzsimulationen änderten sich die Mengen an intrazellulärem K+, Na+ und Cl− schnell; Die Zeiten für die Rückkehr von K+, Na+ und Cl− zu ihren ursprünglichen Werten betrugen jedoch etwa 700 s, was anschließend die Energieausgleichszeiten verlängerte. Die Änderungen der intrazellulären Konzentration zeigten keinen signifikanten Unterschied im Umkehrpotential und hatten daher keinen Einfluss auf die Ionenströme. Dennoch ist unklar, ob die Ansammlung oder Erschöpfung von K+-, Na+- und Cl−-Ionen eine Netzhauterkrankung in Mausstäbchen verursacht.

Diese Studie konzentriert sich auf die Verwendung mathematischer Formeln zur Bewertung der Aktivitäten von Ionenströmen und Faktoren, die den ATP-Verbrauch in Mausstäbchen-Photorezeptoren sowohl bei Dunkelheit als auch bei Lichteinwirkung steuern. Das Modell spiegelt effektiv physiologische Bereiche wider und orientiert sich dadurch eng an empirischen Beobachtungen. Basierend auf den Erkenntnissen aus kontrollierten physiologischen Experimenten konzentriert sich das aktuell vorgeschlagene Modell auf die kurzfristigen Regulierungsmechanismen, die den Zellstatus steuern. Es umfasst jedoch nicht den breiteren Kontext langfristiger zellulärer Umbauprozesse. Zukünftige Untersuchungen werden sich mit der Erforschung spezifischer Übergangszustände befassen, insbesondere mit solchen, die einen Übergang von physiologischen zu pathophysiologischen Zuständen beinhalten. Diese Untersuchung wird die Auswirkungen von mitochondrialer Dysfunktion, Hypoxie und Genmutationen auf die Energienutzung umfassen. Umgekehrt birgt eine umfassende Untersuchung des Energieaufwands von Zapfen-Photorezeptoren, die für ihren erhöhten Energiebedarf im Vergleich zu Stäbchen sowohl unter dunklen als auch hellen Bedingungen bekannt sind17, das Potenzial, tiefgreifende Einblicke in die grundlegenden Unterschiede zwischen den Energieregulierungsmechanismen von Stäbchen und Zapfen zu liefern.

Darüber hinaus kann das aktuelle Modell einen praktischen Rahmen für zukünftige klinische und experimentelle Studien bieten, um die Pathophysiologie der Netzhaut besser zu verstehen und mögliche zukünftige Behandlungen zu verbessern. Allerdings sind weitere Forschungen zur Kopplung des Photorezeptormodells mit Experimenten dringend erforderlich, um die wissenschaftlichen Lücken in dem komplexen Phänomen zu schließen und die Genauigkeit und Spezifität des Modells zu erhöhen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel [und seinen ergänzenden Informationsdateien] enthalten. Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde finanziell durch einen Grant-in-Aid for Research Activity Start-up der Japan Society for the Promotion of Science (22K20514) unterstützt. Wir danken Professor Chieko Koike, unserer Projektleiterin bei der Ritsumeikan Global Innovation Research Organization, für ihre engagierte Unterstützung und Anleitung zu diesem Manuskript. Wir möchten Professor Daniele Dell'Orco und Professor Lorenzo Cangiano unseren Dank und unsere Wertschätzung für die Bereitstellung eines umfassenden Modells der Phototransduktionskaskade und die fruchtbaren Diskussionen zur Ionenflussanalyse aussprechen.

Abteilung für Bioinformatik, College of Life Sciences, Ritsumeikan-Universität, Shiga, Japan

Yuttamol Muangkram, Yukiko Himeno und Akira Amano

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YM entwickelte und analysierte das Modell und verfasste das Manuskript. YH validierte das Modell und überarbeitete das Manuskript. AA überwachte die Studie und überarbeitete das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Yuttamol Muangkram.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Muangkram, Y., Himeno, Y. & Amano, A. Klärung der Zusammensetzung der ATP-Verbrauchsfaktoren, die für die Aufrechterhaltung der Ionenhomöostase in Mausstäbchen-Photorezeptoren erforderlich sind. Sci Rep 13, 14161 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40663-y

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Eingegangen: 11. April 2023

Angenommen: 16. August 2023

Veröffentlicht: 29. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40663-y

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